衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《人粒細胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》的通知

來源: 律霸小編整理 · 2021-01-10 · 5545人看過
衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)〔2008〕18號 各省、自治區(qū)、直轄市衛(wèi)生廳局,新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團衛(wèi)生局: 近年來,我國部分地區(qū)首次出現(xiàn)人粒細胞無形體病疫情。為了提高醫(yī)務(wù)人員對人粒細胞無形體病的認識,加強醫(yī)療機構(gòu)的預(yù)防控制工作,規(guī)范病例診斷與報告、標本采集與檢測、疫情控制與應(yīng)急處置等方面的工作,我部組織專家制定了《人粒細胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》。現(xiàn)印發(fā)給你們,請遵照執(zhí)行。 二○○八年二月十九日 人粒細胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南 (試行) 人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是由嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum,曾稱為“人粒細胞埃立克體,Human granulocytic ehrlichiae”)侵染人末梢血中性粒細胞引起,以發(fā)熱伴白細胞、血小板減少和多臟器功能損害為主要臨床表現(xiàn)的蜱傳疾病。自1994年美國報告首例人粒細胞無形體病病例以來,近年來美國每年報告的病例約600~800人。2006年,我國在安徽省發(fā)現(xiàn)人粒細胞無形體病病例,其他部分省份也有疑似病例發(fā)生。該病臨床癥狀與某些病毒性疾病相似,容易發(fā)生誤診,嚴重者可導(dǎo)致死亡。為指導(dǎo)臨床醫(yī)生和疾病預(yù)防控制專業(yè)人員做好該病的發(fā)現(xiàn)、報告、診斷、治療、個人防護、實驗室檢測和疫情防控與應(yīng)急處置工作,加強公眾健康教育,制定本技術(shù)指南。 一、目的 (一)指導(dǎo)各級醫(yī)療機構(gòu)正確開展人粒細胞無形體病的診斷和治療,及時報告病例并做好個人防護和院內(nèi)感染的控制工作。 (二)指導(dǎo)各級疾病預(yù)防控制機構(gòu)開展人粒細胞無形體病流行病學(xué)調(diào)查、實驗室檢測和疫情監(jiān)測控制工作。 (三)指導(dǎo)各地開展人粒細胞無形體病流行病學(xué)、病原學(xué)及防控策略的研究。 (四)指導(dǎo)各地做好預(yù)防人粒細胞無形體病的健康教育工作。 二、疾病概述 (一)病原學(xué)。 嗜吞噬細胞無形體屬于立克次體目、無形體科、無形體屬。無形體科是一類主要感染白細胞的專性細胞內(nèi)寄生革蘭陰性小球桿菌,其中對人致病的病原體主要包括無形體屬(Anaplasma)的嗜吞噬細胞無形體、埃立克體屬(Ehrlichia)的查菲埃立克體(E. chaffeensis)和埃文氏埃立克體(E.ewingii)、新立克次體屬(Neorickettsia)的腺熱新立克次體(N. sennetsu),分別引起人粒細胞無形體病、人單核細胞埃立克體病(Human monocytic ehrlichiosis, HME)、埃文氏埃立克體感染、腺熱新立克次體病。 90年代初期,美國在多例急性發(fā)熱病人的中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)埃立克體樣包涵體。1995年,Goodman等從病人的血標本分離到該種嗜粒細胞病原體,將它非正式命名為人粒細胞埃立克體,其所致疾病稱為人粒細胞埃立克體病。后經(jīng)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)該種嗜粒細胞病原體與無形體屬最相關(guān),因此,將其歸于無形體屬的一個新種,命名為嗜吞噬細胞無形體,其所致疾病也改稱為人粒細胞無形體病。 1. 形態(tài)結(jié)構(gòu)及培養(yǎng)特性 嗜吞噬細胞無形體呈球狀多型性,革蘭氏染色陰性,主要寄生在粒細胞的胞質(zhì)空泡內(nèi),以膜包裹的包涵體形式繁殖。用Giemsa法染色,嗜吞噬細胞無形體包涵體在胞質(zhì)內(nèi)染成紫色,呈桑葚狀(圖-1)。 嗜吞噬細胞無形體為專性細胞內(nèi)寄生菌,缺乏經(jīng)典糖代謝途徑,依賴宿主酶系統(tǒng)進行代謝及生長繁殖,主要侵染人中性粒細胞。嗜吞噬細胞無形體的體外分離培養(yǎng)使用人粒細胞白血病細胞系(HL-60),主要存在于HL-60細胞內(nèi)與膜結(jié)構(gòu)相連的空泡內(nèi),生長繁殖迅速。其感染的空泡內(nèi)無查菲埃立克體感染所形成的纖維樣結(jié)構(gòu)。嗜吞噬細胞無形體早期的形態(tài)多為圓形、密度較大的網(wǎng)狀體,后期菌體變小且密度增大。嗜吞噬細胞無形體的外膜比查菲埃立克體外膜有更多的皺折(圖-2)。 圖1 人血液中性粒細胞內(nèi)無形體包涵體(X1000, JS Dumler) 圖2 電鏡下的無形體包涵體(X21960, JS Dumler) 2. 遺傳及表型特征 嗜吞噬細胞無形體的基因組為1,471,282個堿基對,G+C含量為41.6%,含有1,369個編碼框(ORF)。特征性基因為msp2以及AnkA基因,100%的菌株具有msp2,70%的菌株具有AnkA基因。 (二)流行病學(xué)。 1. 宿主動物與傳播媒介 動物宿主持續(xù)感染是病原體維持自然循環(huán)的基本條件。國外報道,嗜吞噬細胞無形體的儲存宿主包括白足鼠等野鼠類以及其他動物。在歐洲,紅鹿、牛、山羊均可持續(xù)感染嗜吞噬細胞無形體。 國外報道,嗜吞噬細胞無形體的傳播媒介主要是硬蜱屬的某些種(如肩突硬蜱、篦子硬蜱等)。我國曾在黑龍江內(nèi)蒙古及新疆等地的全溝硬蜱中檢測到嗜吞噬細胞無形體核酸。 我國的儲存宿主、媒介種類及其分布尚需做進一步調(diào)查。 2. 傳播途徑 (1)主要通過蜱叮咬傳播。蜱叮咬攜帶病原體的宿主動物后,再叮咬人時,病原體可隨之進入人體引起發(fā)病。 (2)直接接觸危重病人或帶菌動物的血液等體液,有可能會導(dǎo)致傳播,但具體傳播機制尚需進一步研究證實。國外曾有屠宰場工人因接觸鹿血經(jīng)傷口感染該病的報道。 3. 人群易感性 人對嗜吞噬細胞無形體普遍易感,各年齡組均可感染發(fā)病。 高危人群主要為接觸蜱等傳播媒介的人群,如疫源地(主要為森林、丘陵地區(qū))的居民、勞動者及旅游者等。與人粒細胞無形體病危重患者密切接觸、直接接觸病人血液等體液的醫(yī)務(wù)人員或其陪護者,如不注意防護,也有感染的可能。 4. 地理分布和發(fā)病季節(jié)特點 目前,已報道有人粒細胞無形體病的國家有美國、斯洛文尼亞、法國、英國、德國、澳大利亞、意大利及韓國等,但僅美國和斯洛文尼亞分離到病原體。根據(jù)國外研究,該病與萊姆病的地區(qū)分布相似,我國萊姆病流行區(qū)亦應(yīng)關(guān)注此病。 該病全年均有發(fā)病,發(fā)病高峰為5-10月。不同國家的報道略有差異,多集中在當?shù)仳缁顒虞^為活躍的月份。 (三)主要病理改變及臨床表現(xiàn)。 病理改變包括多臟器周圍血管淋巴組織炎癥浸潤、壞死性肝炎、脾及淋巴結(jié)單核吞噬系統(tǒng)增生等,主要與免疫損傷有關(guān)。嗜吞噬細胞無形體感染中性粒細胞后,可影響宿主細胞基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡,細胞因子產(chǎn)生紊亂、吞噬功能缺陷,進而造成免疫病理損傷。 潛伏期一般為7-14天(平均9天)。急性起病,主要癥狀為發(fā)熱、全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛,以及惡心、嘔吐、厭食、腹瀉等。實驗室檢查外周血象白細胞、血小板降低,肝酶升高。嚴重者可發(fā)展為多臟器功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血,甚至死亡。老年患者及免疫缺陷患者感染本病后病情多較危重。 三、診斷、治療和報告 醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)按照《人粒細胞無形體病診療方案(試行)》(附件1)做好診斷和治療。同時,應(yīng)加強醫(yī)務(wù)人員的個人防護和院內(nèi)感染控制工作。 各級醫(yī)療機構(gòu)發(fā)現(xiàn)符合病例定義的人粒細胞無形體病疑似、臨床診斷或確診病例時,應(yīng)參照乙、丙類傳染病的報告要求于24小時內(nèi)通過國家疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)直報,報告疾病類別選擇“其它傳染病”。符合《國家突發(fā)公共衛(wèi)生事件相關(guān)信息報告管理工作規(guī)范(試行)》要求的,按照相應(yīng)的規(guī)定進行報告。 四、實驗室檢測 各級疾病預(yù)防控制機構(gòu)專業(yè)人員和臨床醫(yī)務(wù)人員發(fā)現(xiàn)疑似病例時,應(yīng)認真按照《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》(附件3)進行標本的采集、包裝、運送和實驗室檢測。省級實驗室無檢測條件或無法鑒定時,應(yīng)將原始標本及病原分離物送中國疾病預(yù)防控制中心進行檢測。 五、流行病學(xué)調(diào)查 疾病預(yù)防控制機構(gòu)接到疫情報告后,應(yīng)按照《人粒細胞無形體病流行病學(xué)調(diào)查方案(試行)》(附件2),立即組織專業(yè)人員開展流行病學(xué)調(diào)查,追溯可能的感染來源,調(diào)查傳播途徑及相關(guān)影響因素,填寫《人粒細胞無形體病個案調(diào)查表》(見附件2附表)。 出現(xiàn)聚集性病例時,應(yīng)開展病例的主動搜索,并通過對傳染源、傳播途徑、傳播媒介及相關(guān)影響因素等的調(diào)查分析,及時提出有針對性的預(yù)防控制措施。 六、專題調(diào)查 有條件的地區(qū),疾病預(yù)防控制機構(gòu)可根據(jù)當?shù)匾咔榈奶攸c,參照《人粒細胞無形體病專題調(diào)查方案(試行)》(附件4),組織開展人群血清流行病學(xué)、宿主動物和傳播媒介等方面的專題調(diào)查。 七、預(yù)防控制措施 (一)做好公眾預(yù)防的指導(dǎo)和健康教育。 避免蜱叮咬是降低感染風險的主要措施。預(yù)防該病的主要策略是指導(dǎo)公眾、特別是高危人群減少或避免蜱的暴露。有蜱叮咬史或野外活動史者,一旦出現(xiàn)疑似癥狀或體征,應(yīng)及早就醫(yī),并告知醫(yī)生相關(guān)暴露史。 蜱主要棲息在草地、樹林等環(huán)境中,應(yīng)盡量避免在此類環(huán)境中長時間坐臥。如需進入此類地區(qū),尤其是已發(fā)現(xiàn)過病人的地區(qū),應(yīng)注意做好個人防護,穿著緊口、淺色、光滑的長袖衣服,可防止蜱的附著或叮咬,且容易發(fā)現(xiàn)附著的蜱。也可在暴露的皮膚和衣服上噴涂避蚊胺(DEET)等驅(qū)避劑進行防護。在蜱棲息地活動時或活動后,應(yīng)仔細檢查身體上有無蜱附著。蜱常附著在人體的頭皮、腰部、腋窩、腹股溝及腳踝下方等部位。如發(fā)現(xiàn)蜱附著在身體上,應(yīng)立即用鑷子等工具將蜱除去。因蜱體上或皮膚破損處的液體可能含有傳染性病原體,不要直接用手將蜱摘除或用手指將蜱捏碎。 蜱可寄生在家畜或?qū)櫸锏捏w表。如發(fā)現(xiàn)動物體表有蜱寄生時,應(yīng)減少與動物的接觸,避免被蜱叮咬。 (二)開展醫(yī)療衛(wèi)生專業(yè)人員培訓(xùn)。 各地應(yīng)開展對醫(yī)務(wù)人員和疾控人員的培訓(xùn)工作,提高醫(yī)務(wù)人員發(fā)現(xiàn)、識別人粒細胞無形體病的能力,規(guī)范其治療行為,以降低病死率;提高疾控人員的流行病學(xué)調(diào)查和疫情處置能力,控制疫情的蔓延和流行。 (三)提高實驗室診斷能力。 發(fā)現(xiàn)疑似病例時,應(yīng)及時采集標本開展實驗室檢測。各省級疾病預(yù)防控制中心應(yīng)逐步提高對該病的實驗室檢測能力,建立實驗室檢測的相關(guān)技術(shù)和方法。已發(fā)生或可能發(fā)生疫情的地區(qū)及有條件的地市級疾病預(yù)防控制中心和醫(yī)療機構(gòu)也應(yīng)逐步建立該病的實驗室診斷能力。 (四)媒介與宿主動物的控制。 出現(xiàn)暴發(fā)疫情時,應(yīng)采取滅殺蜱、鼠和環(huán)境清理等措施,降低環(huán)境中蜱和鼠的密度。 (五)病人的管理。 對病人的血液、分泌物、排泄物及被其污染的環(huán)境和物品,應(yīng)進行消毒處理。一般不需要對病人實施隔離。 附件:1. 人粒細胞無形體病診療方案(試行) 2. 人粒細胞無形體病流行病學(xué)調(diào)查方案(試行) 3. 人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行) 4. 人粒細胞無形體病專題調(diào)查方案(試行) 附件1 人粒細胞無形體病診療方案 (試行) 為指導(dǎo)各地及時、有效地開展人粒細胞無形體病的診斷和救治工作,減少危重和死亡病例,防止院內(nèi)感染的發(fā)生,特制定本方案。 一、臨床表現(xiàn) 潛伏期一般為7-14天(平均9天)。急性起病,主要癥狀為發(fā)熱(多為持續(xù)性高熱,可高達40℃以上)、全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛,以及惡心、嘔吐、厭食、腹瀉等。部分患者伴有咳嗽、咽痛。體格檢查可見表情淡漠,相對緩脈,少數(shù)病人可有淺表淋巴結(jié)腫大及皮疹。可伴有心、肝、腎等多臟器功能損害,并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。 重癥患者可有間質(zhì)性肺炎、肺水腫、急性呼吸窘迫綜合癥以及繼發(fā)細菌、病毒及真菌等感染。少數(shù)病人可因嚴重的血小板減少及凝血功能異常,出現(xiàn)皮膚、肺、消化道等出血表現(xiàn),如不及時救治,可因呼吸衰竭、急性腎衰等多臟器功能衰竭以及彌漫性血管內(nèi)凝血死亡。 老年患者、免疫缺陷患者及進行激素治療者感染本病后病情多較危重。 二、實驗室檢查 實驗室檢查外周血象白細胞、血小板降低,異型淋巴細胞增多。合并臟器損害的患者,心、肝、腎功能檢測異常。病原學(xué)和血清學(xué)檢查陽性。其中: 血常規(guī):白細胞、血小板減少可作為早期診斷的重要線索。病人發(fā)病第一周即表現(xiàn)有白細胞減少,多為1.0-3.0×109/L; 血小板降低,多為30-50×109/L。可見異型淋巴細胞。 尿常規(guī):蛋白尿、血尿、管形尿。 血生化檢查: 肝、腎功能異常;心肌酶譜升高;少數(shù)患者出現(xiàn)血淀粉酶、尿淀粉酶和血糖升高。 部分患者凝血酶原時間延長,纖維蛋白原降解產(chǎn)物升高。可有血電解質(zhì)紊亂,如低鈉、低氯、低鈣等。少數(shù)病人還有膽紅素及血清蛋白降低。 三、并發(fā)癥 如延誤治療,患者可出現(xiàn)機會性感染、敗血癥、中毒性休克、中毒性心肌炎、急性腎衰、呼吸窘迫綜合癥、彌漫性血管內(nèi)凝血及多臟器功能衰竭等,直接影響病情和預(yù)后。 四、病例診斷 依據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢測結(jié)果進行診斷。 (一)流行病學(xué)史。 1. 發(fā)病前2周內(nèi)有被蜱叮咬史; 2. 在有蜱活動的丘陵、山區(qū)(林區(qū))工作或生活史; 3. 直接接觸過危重患者的血液等體液。 (二)臨床表現(xiàn)。 急性起病,主要癥狀為發(fā)熱(多為持續(xù)性高熱,可高達40℃以上)、全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛,以及惡心、嘔吐、厭食、腹瀉等。個別重癥病例可出現(xiàn)皮膚瘀斑、出血,伴多臟器損傷、彌漫性血管內(nèi)凝血等。 (三)實驗室檢測。 1. 血常規(guī)及生化檢查 (1)早期外周血象白細胞、血小板降低,嚴重者呈進行性減少,異型淋巴細胞增多。 (2)末梢血涂片鏡檢中性粒細胞內(nèi)可見桑葚狀包涵體。 (3)谷丙(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,ALT)和/或谷草(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,AST)轉(zhuǎn)氨酶升高。 2. 血清及病原學(xué)檢測 (1)急性期血清間接免疫熒光抗體(IFA)檢測嗜吞噬細胞無形體IgM抗體陽性。 (2)急性期血清IFA檢測嗜吞噬細胞無形體IgG抗體陽性。 (3)恢復(fù)期血清IFA檢測嗜吞噬細胞無形體IgG抗體滴度較急性期有4倍及以上升高。 (4)全血或血細胞標本PCR檢測嗜吞噬細胞無形體特異性核酸陽性,且序列分析證實與嗜吞噬細胞無形體的同源性達99%以上。 (5)分離到病原體。 (四)診斷標準。 疑似病例:具有上述(一)、(二)項和(三)項1項中的(1)、(3)。部分病例可能無法獲得明確的流行病學(xué)史。 臨床診斷病例:疑似病例同時具備(三)項1項中的(2),或(三)項2項中的(1)或(2)。 確診病例:疑似病例或臨床診斷病例同時具備(三)項2項中(3)、(4)、(5)中的任一項。 五、鑒別診斷 (一)與其他蜱傳疾病、立克次體病的鑒別:人單核細胞埃立克體病(HME)、斑疹傷寒、恙蟲病、斑點熱以及萊姆病等。 (二)與發(fā)熱、出血及酶學(xué)指標升高的感染性疾病的鑒別:主要是病毒性出血性疾病,如流行性出血熱、登革熱等。 (三)與發(fā)熱、血白細胞、血小板降低的胃腸道疾病的鑒別:傷寒、急性胃腸炎、病毒性肝炎。 (四)與發(fā)熱及血白細胞、血小板降低或有出血傾向的內(nèi)科疾病的鑒別:主要是血液系統(tǒng)疾病,如血小板減少性紫癜,粒細胞減少、骨髓異常增生綜合征。可通過骨髓穿刺及相應(yīng)病原體檢測進行鑒別。 (五)與發(fā)熱伴多項酶學(xué)指標升高的內(nèi)科疾病鑒別:主要是免疫系統(tǒng)疾病,如皮肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕熱。可通過自身抗體等免疫學(xué)指標進行鑒別。 (六)其他:如支原體感染、鉤端螺旋體病、鼠咬熱、藥物反應(yīng)等。 六、治療 及早使用抗生素,避免出現(xiàn)并發(fā)癥。對疑似病例可進行經(jīng)驗性治療。一般慎用激素類藥物,以免加重病情。 (一)病原治療。 1. 四環(huán)素類抗生素 (1)強力霉素。為首選藥物,應(yīng)早期、足量使用。成人口服:0.1g/次, 1日2次, 必要時首劑可加倍。8歲以上兒童常用量:首劑4mg/kg;之后,每次2mg/kg, 1日2次。一般病例口服即可,重癥患者可考慮靜脈給藥。 (2)四環(huán)素。口服:成人常用量為0.25-0.5g/次,每6小時1次;8歲以上兒童常用量為一日25-50 mg/kg,分4次服用。靜脈滴注:成人一日1-1.5g,分2-3次給藥;8歲以上兒童為一日10-20 mg/kg,分2次給藥,每日劑量不超過1g。住院患者主張靜脈給藥。四環(huán)素毒副作用較多,孕婦和兒童慎用。 強力霉素或四環(huán)素治療療程不少于7天。一般用至退熱后至少3天,或白細胞及血小板計數(shù)回升,各種酶學(xué)指標基本正常,癥狀完全改善。早期使用強力霉素或四環(huán)素等藥物,一般可在24-48小時內(nèi)退熱。因人粒細胞無形體病臨床表現(xiàn)無特異性,尚缺乏快速的實驗室診斷方法,可對疑似病例進行經(jīng)驗性治療,一般用藥3-4天仍不見效者,可考慮排除人粒細胞無形體病的診斷。 2.利福平:兒童、對強力霉素過敏或不宜使用四環(huán)素類抗生素者,選用利福平。成人450-600mg,兒童10 mg/kg,每日一次口服。 3.喹諾酮類:如左氧氟沙星等。 磺胺類藥有促進病原體繁殖作用,應(yīng)禁用。 (二)一般治療。 患者應(yīng)臥床休息,高熱量、適量維生素、流食或半流食,多飲水,注意口腔衛(wèi)生,保持皮膚清潔。 對病情較重患者,應(yīng)補充足夠的液體和電解質(zhì),以保持水、電解質(zhì)和酸堿平衡;體弱或營養(yǎng)不良、低蛋白血癥者可給予胃腸營養(yǎng)、新鮮血漿、白蛋白、丙種球蛋白等治療,以改善全身機能狀態(tài)、提高機體抵抗力。 (三)對癥支持治療。 1. 對高熱者可物理降溫,必要時使用藥物退熱。 2. 對有明顯出血者,可輸血小板、血漿。 3. 對合并有彌漫性血管內(nèi)凝血者,可早期使用肝素。 4. 對粒細胞嚴重低下患者,可用粒細胞集落刺激因子。 5. 對少尿患者,應(yīng)堿化尿液,注意監(jiān)測血壓和血容量變化。對足量補液后仍少尿者,可用利尿劑。如出現(xiàn)急性腎衰時,可進行相應(yīng)處理。 6. 心功能不全者,應(yīng)絕對臥床休息,可用強心藥、利尿劑控制心衰。 7. 應(yīng)慎用激素。國外有文獻報道,人粒細胞無形體病患者使用糖皮質(zhì)激素后可能會加重病情并增強疾病的傳染性,故應(yīng)慎用。對中毒癥狀明顯的重癥患者,在使用有效抗生素進行治療的情況下,可適當使用糖皮質(zhì)激素。 (四)隔離及防護。 對于一般病例,按照蟲媒傳染病進行常規(guī)防護。在治療或護理危重病人時,尤其病人有出血現(xiàn)象時,醫(yī)務(wù)人員及陪護人員應(yīng)加強個人防護。做好病人血液、分泌物、排泄物及其污染環(huán)境和物品的消毒處理。 (五)出院標準。 體溫正常、癥狀消失、臨床實驗室檢查指標基本正常或明顯改善后,可出院。 (六)預(yù)后。 據(jù)國外報道,病死率低于1%。如能及時處理,絕大多數(shù)患者預(yù)后良好。如出現(xiàn)敗血癥、中毒性休克、中毒性心肌炎、急性腎衰、呼吸窘迫綜合癥、彌漫性血管內(nèi)凝血及多臟器功能衰竭等嚴重并發(fā)癥的患者,易導(dǎo)致死亡。 附件2 人粒細胞無形體病流行病學(xué)調(diào)查方案 (試行) 為做好人粒細胞無形體病疫情的流行病學(xué)調(diào)查,準確描述和分析疫情特征,科學(xué)制訂防控策略和措施,特制定本方案。 一、調(diào)查目的 (一)為病例的核實診斷提供流行病學(xué)證據(jù)。 (二)為了解該病在我國的流行病學(xué)及臨床特征積累數(shù)據(jù)。 二、調(diào)查對象 (一)散發(fā)病例:包括疑似病例、臨床診斷病例、實驗室確診病例。 (二)聚集性病例:在同一村莊,或在同一山坡、樹林、茶園、景區(qū)等地勞動或旅游的人員中,2周內(nèi)出現(xiàn)2例及以上人粒細胞無形體病(疑似)病例,或在病例的密切接觸者中出現(xiàn)類似病例。 三、調(diào)查內(nèi)容和方法 (一)個案調(diào)查和標本采集。 發(fā)現(xiàn)人粒細胞無形體病病例后,應(yīng)及時開展流行病學(xué)個案調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括病例的基本情況、家庭及居住環(huán)境、暴露史、發(fā)病經(jīng)過、就診情況、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、診斷、轉(zhuǎn)歸、密切接觸者情況等(見附表《人粒細胞無形體病個案調(diào)查表》),并采集相關(guān)標本(見附件3《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》)。 1. 基本情況 包括年齡、性別、住址、職業(yè)、文化程度、旅行史等。 2.臨床資料 通過查閱病歷及化驗記錄、詢問經(jīng)治醫(yī)生及病例、病例家屬等方法,詳細了解病例的發(fā)病經(jīng)過、就診情況、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結(jié)果、診斷、治療、疾病進展、轉(zhuǎn)歸等情況。 3. 病例家庭及居住環(huán)境情況 通過詢問及現(xiàn)場調(diào)查,了解病例及其家庭成員情況、家庭居住位置、環(huán)境、家禽及家畜飼養(yǎng)情況等。 4. 暴露史及病例發(fā)病前活動范圍 (1) 詢問病例發(fā)病前2周內(nèi)勞動、旅行或可疑暴露史,了解其是否到過有蜱生長的場所,是否有蜱叮咬史。 (2) 詢問病例發(fā)病前2周內(nèi)與類似病例的接觸情況,包括接觸時間、方式、頻率、地點、接觸時采取的防護措施等。 5. 密切接觸者 如病例出現(xiàn)出血并污染周圍環(huán)境、物品時,應(yīng)對醫(yī)務(wù)人員、陪護人員或其他密切接觸者開展追蹤調(diào)查,必要時應(yīng)采集相關(guān)標本進行檢測。 (二)聚集性病例的調(diào)查。 在出現(xiàn)聚集性病例或暴發(fā)疫情時,應(yīng)注意調(diào)查感染來源。如懷疑有人傳人可能時,應(yīng)評估人群感染及人傳人的風險。應(yīng)組織疾控人員或醫(yī)務(wù)人員,采用查看當?shù)蒯t(yī)療機構(gòu)門診日志、住院病歷等臨床資料、入戶調(diào)查等方式,開展病例的主動搜索,并對搜索出的疑似病例進行篩查、隨訪。追蹤疑似病例、臨床診斷病例及實驗室確診病例的密切接觸者,必要時采集相關(guān)樣本進行檢測。 通過查閱資料、咨詢當?shù)叵嚓P(guān)部門等方法,了解當?shù)刈匀簧鷳B(tài)環(huán)境、媒介分布,以及相關(guān)的人口、氣象、生產(chǎn)、生活資料等情況。 四、調(diào)查要求 (一)調(diào)查者及調(diào)查對象。 應(yīng)由經(jīng)過培訓(xùn)的縣(區(qū))級疾病預(yù)防控制機構(gòu)專業(yè)人員擔任調(diào)查員。現(xiàn)場調(diào)查時,應(yīng)盡可能直接對病人進行訪視、詢問。如病人病情較重,或病人已死亡,或其他原因無法直接調(diào)查時,可通過其醫(yī)生、親友、同事或其他知情者進行調(diào)查、核實或補充。 (二)調(diào)查時間及調(diào)查內(nèi)容。 應(yīng)在接到疫情報告后迅速開展流行病學(xué)調(diào)查,調(diào)查內(nèi)容見附表《人粒細胞無形體病個案調(diào)查表》。調(diào)查表應(yīng)填寫完整,實驗室檢測結(jié)果、病人轉(zhuǎn)歸等情況應(yīng)及時填補到調(diào)查表中,以完善相關(guān)信息。 (三)調(diào)查者的個人防護。 在流行病學(xué)調(diào)查及標本采集過程中,調(diào)查者應(yīng)采取相應(yīng)的個人防護措施,尤其應(yīng)注意避免被蜱叮咬或直接接觸病人的血液、分泌物或排泄物等。 五、調(diào)查資料的分析、總結(jié)和利用 (一)在疫情調(diào)查處理進程中或結(jié)束后,應(yīng)及時對流行病學(xué)資料進行整理、分析,撰寫流行病學(xué)調(diào)查報告,并及時向上級疾病預(yù)防控制機構(gòu)及同級衛(wèi)生行政部門報告。 (二)疫情調(diào)查結(jié)束后,各省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)及時將人粒細胞無形體病流行病學(xué)個案調(diào)查表及流行病學(xué)調(diào)查報告上報中國疾病預(yù)防控制中心。 (三)疫情調(diào)查結(jié)束后,各地疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)將流行病學(xué)調(diào)查的原始資料、分析結(jié)果及調(diào)查報告及時整理歸檔。 附表 人粒細胞無形體病個案調(diào)查表 編碼□□□□□□□□ 1 一般情況 1.1姓名: (14歲以下同時填寫家長姓名 ) 1.2性別: ①男 ②女 □ 1.3出生日期: 年 月 日(若無詳細日期,填寫實足年齡 歲) 1.4職業(yè): (1)幼托兒童 (2)散居兒童 (3)學(xué)生 (4)教師 (5)保育員/保姆 (6)餐飲業(yè) (7)公共場所服務(wù)業(yè) (8)商業(yè)服務(wù)業(yè)(17)旅游服務(wù)業(yè) (9)醫(yī)務(wù)人員 (13)干部職員 (10)工人 (11)民工 (12)農(nóng)民 (16)林業(yè) (20)采茶 (21)牧民 (18)狩獵 (19)銷售/加工野生動物 (14)離退人員 (15)家務(wù)待業(yè) (22)不詳 (23)其他 □ 1.5工作單位: 1.6現(xiàn)住址:  省    市(地、州) 縣(市、區(qū)) 鄉(xiāng)(鎮(zhèn)、街道) 村(居委會) 組(門牌) 1.7聯(lián)系電話: 聯(lián)系人: 與患者關(guān)系: 2 發(fā)病情況 2.1發(fā)病時間: 年 月 日 2.2就診情況 就診次數(shù) 就診日期 就診醫(yī)療機構(gòu) 診斷 使用抗生素名稱 使用激素名稱 第1次 第2次 第3次 第4次 2.3 現(xiàn)住醫(yī)院入院時間: 年 月 日 2.4住院號: 2.5入院診斷: 2.6是否出院:①是 ②否 □ 如已出院: 2.6.1出院診斷: 2.6.2出院時間: 年 月 日 2.7 本次調(diào)查時病人情況: ①痊愈 ②好轉(zhuǎn) ③惡化 ④死亡 □ 2.8 最后轉(zhuǎn)歸: ①痊愈 ②死亡 ③其它 □ 3 臨床表現(xiàn) 3.1首發(fā)癥狀、體征: 3.2主要癥狀、體征: 3.2.1發(fā)熱 最高: ℃ 入院時: ℃ □ 3.2.2畏寒 ①有 ②無 □ 3.2.3頭痛 ①有 ②無 □ 3.2.4頭暈 ①有 ②無 □ 3.2.5乏力 ①有 ②無 □ 3.2.6全身酸痛 ①有 ②無 □ 3.2.7淋巴結(jié)腫大①有 ②無 □ 3.2.7.1若有,腫大部位及大小: 3.2.8鞏膜黃染 ①有 ②無 □ 3.2.8.1若有,出現(xiàn)時間: 年 月 日 3.2.9眼結(jié)膜充 ①有 ②無 □ 3.2.10皮膚淤點 ①有 ②無 □ 3.2.10.1若有, 出現(xiàn)部位: 3.2.10.2出現(xiàn)時間: 年 月 日 3.2.11皮膚淤斑 ①有 ②無 □ 3.2.11.1若有, 出現(xiàn)部位: 3.2.11.2出現(xiàn)時間: 年 月 日 3.2.12牙齦出血①有 ②無 □ 3.2.13有無皮疹①有 ②無 □ 3.2.13.1若有, 出現(xiàn)部位: 3.2.13.2 皮疹性質(zhì): 3.2.13.3出現(xiàn)時間: 年 月 日 3.3 呼吸系統(tǒng)癥狀 3.3.1咳嗽 ①有 ②無 □ 3.3.2咳痰 ①有 ②無 □ 3.3.3咯血 ①有 ②無 □ 3.3.4呼吸困難 ①有 ②無 □ 3.4 消化系統(tǒng)癥狀 3.4.1食欲減退 ①輕度 ②厭食 ③無 □ 3.4.2惡心 ①有 ②無 □ 3.4.3嘔吐 ①有 ②無 □ 3.4.4嘔血 ①有 ②無 □ 3.4.5腹痛 ①有 ②無 □ 3.4.5.1腹痛部位 ①上腹部 ②下腹部 ③其它 □ 3.4.5.2腹痛性質(zhì) ①絞痛 ②灼燒樣痛 ③鈍痛 ④壓痛 ⑤其它 □ 3.4.6腹脹 ①有 ②無 □ 3.4.7腹瀉 ①有, 次/天 ②無 □ 3.4.8大便性狀 ①血便 ②黑便 ③水樣便 ④其它 □ 3.4.9口腔潰瘍 ①有 ②無 □ 3.5 運動系統(tǒng)癥狀 3.5.1關(guān)節(jié)疼痛 ①有 ②無 □ 3.5.1.1 部位: 3.5.2肌肉疼痛 ①有 ②無 □ 3.5.2.1部位: 3.6 循環(huán)系統(tǒng)癥狀 3.6.1心慌 ①有 ②無 □ 3.6.2相對緩脈 ①有 ②無 □ 3.6.3胸悶 ①有 ②無 □ 3.6.4胸痛 ①有 ②無 □ 3.7 泌尿系統(tǒng)癥狀 3.7.1尿急、尿頻①有 ②無 □ 3.7.2腎區(qū)疼痛 ①有 ②無 □ 3.8 精神神經(jīng)癥狀 3.8.1表情淡漠 ①有 ②無 □ 3.8.2煩躁 ①有 ②無 □ 3.8.3抽搐 ①有 ②無 □ 3.8.4昏迷 ①有 ②無 □ 3.9 其它: 4 實驗室檢查 4.1 血常規(guī) 序次 檢查日期 WBC(109/L) N(%) L(%) 異型淋巴細胞 PLT(109/L) 檢測單位 4.2 尿常規(guī) 序次 檢查日期 尿蛋白 血尿 管型尿 檢測單位 4.3 肝功能 序次 檢查日期 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 谷草轉(zhuǎn)氨酶 檢測單位 4.4 其它檢測 序次 檢查日期 X-線 腎功能 血糖 出凝血 時間 其他 檢測單位 4.5 血清學(xué)和病原學(xué)檢查 標本類型 采集時間 檢測時間 檢測方法 檢測結(jié)果 檢測單位 5 住院用藥情況(抗生素、激素、生白藥) 用藥名稱 劑量 起始日期 終止日期 6 流行病學(xué)調(diào)查 6.1 發(fā)病前兩周活動史 日期 所到地點 從事活動種類1 頻次 累計停留時間(小時) 暴露方式2 注:1.活動種類(可重復(fù)、多選): ①采茶 ②割草 ③打獵 ④放牧  ⑤采伐 ⑥旅游 ⑦其它: □ 2.暴露方式:①草地休息 ②草叢、灌木叢行走 ③與動物接觸 ④其它 □ 6.2當?shù)厥欠裼序纾绲漠數(shù)厮酌?): ①有 ②無 ③不知道 □ 6.3是否見過蜱(蜱的當?shù)厮酌?): ①是 ②否 ③不認識 □ 6.3.1若見過,地點: 6.4是否被蜱叮咬過①是 ②否 ③不知道 □ 6.4.1若被叮咬過,時間及次數(shù): ①1個月前,次數(shù) ②1個月內(nèi),次數(shù) 第一次叮咬時間: 年 月 日 第二次叮咬時間: 年 月 日 6.4.2叮咬部位(可多選): ①腳 ②腿 ③腹部 ④背部 ⑤頸部 ⑥其他 □ 6.4.3叮咬時有無疼痛感?①有 ②無 □ 6.5發(fā)病前兩周有無皮膚破損: ①有 ②無 □ 6.6是否聽說過類似病例: ①是 ②否 □ 6.6.1 若聽說過,病例姓名: 病例具體住址: 6.7發(fā)病前是否接觸過類似病人: ①是 ②否 □ 6.7.1 所接觸病人情況 姓名 性別 年齡 現(xiàn)住址 關(guān)系 診斷 接觸時間(最早~最晚) 接觸頻次 接觸方式 聯(lián)系方式 注:接觸方式(可多選): ①直接接觸病人血液 ②直接接觸病人分泌物、排泄物 ③救治/護理 ④同處一室 ⑤其它(在表中注明) □ 6.8 飼養(yǎng)與接觸動物情況 動物種類 數(shù)量 動物身上是否有蜱附著 發(fā)病前2周是否與動物接觸 6.9 患者家庭居住地地理環(huán)境描述(地形地貌及附近有無蜱類生長) 6.9.1住宅周圍環(huán)境有無雜草灌木生長: ①有 ②無 □ 6.9.2住室內(nèi)衛(wèi)生狀況: ①好 ②一般 ③差 □ 6.10病前一個月家中是否發(fā)現(xiàn)過老鼠? ①有 ②無 ③不知道 □ 6.11病前一個月內(nèi)是否接觸其它野生動物?①是 ②否 ③不知道 □ 如是,接觸時間: 年 月 日 接觸方式: 7. 調(diào)查小結(jié): 調(diào)查單位: 調(diào)查人員簽名: 調(diào)查時間: 年 月 日 附件3 人粒細胞無形體病實驗室檢測方案 (試行) 為保證及時、科學(xué)地采集、運送人粒細胞無形體病病例(包括疑似病例)及疫源地調(diào)查的各種類型標本,規(guī)范人粒細胞無形體病的實驗室檢測程序,提高檢測質(zhì)量,為明確診斷或開展相關(guān)的科學(xué)研究提供實驗室依據(jù),特制定本方案。 一、樣本采集對象 (一) 人粒細胞無形體病病例(包括疑似病例,以下同)。 (二) 病例密切接觸者或其他健康人群。 (三) 疫源地可疑宿主動物(野生動物及狗、羊、牛等家畜)、媒介蜱。 二、標本種類及采集方法 (一) 抗凝血。 常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml,用于病原分離。應(yīng)盡可能在病人使用抗生素前進行血液的采集。 (二)非抗凝血。 用無菌真空管,采集病例、健康人群及宿主動物非抗凝血5ml,用于血清抗體及PCR檢測。采集后,應(yīng)及時分離血清,將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測用血液采集盡可能在發(fā)病后1周內(nèi),恢復(fù)期抗體檢測標本采集至少間隔2-3周。如第2份血清在1個月之內(nèi)抗體升高不明顯的,應(yīng)建議間隔2-4周后采集第3份血液標本。 (三)包涵體檢測血涂片的制備。 采集血液標本后,制作厚血片,進行紅細胞裂解處理等。 (四)媒介蜱標本的采集。 采集動物體表媒介蜱,用鑷子夾取,放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中,用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實驗室接到蜱標本后,首先應(yīng)進行種屬鑒定,然后按類別分組(1-5只蜱/組),采用75%酒精浸泡30min后,用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗3次。最后進行分組研磨,研磨液用于提取DNA,進行PCR擴增。 (五)有條件時,可采集活檢或尸檢標本,冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進行實驗室檢測。具體方法參照病理實驗室相關(guān)要求和衛(wèi)生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗規(guī)定》的相關(guān)要求。 三、標本采集和保存注意事項 標本采集應(yīng)符合無菌操作要求。抗凝血如不能立即床邊接種,應(yīng)置于4℃環(huán)境保存,避免冰凍(不超過2周)。非抗凝血應(yīng)及時進行無菌分離血清,血清用于抗體檢測,血球部分研磨后提取DNA用于PCR檢測。如不能及時檢測,可暫置于-20℃環(huán)境保存。所有標本應(yīng)置入大小適合、帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi),擰緊管口。 標本采集后,應(yīng)認真填寫采樣登記表。 四、實驗室檢測 (一)包涵體的檢測。 1. 血片及白細胞涂片制備 采集的抗凝血標本盡快用血球?qū)油蒲稍锖罄浔潭?0min;或提取抗凝血中的白細胞并進行涂片,待干燥后冷丙酮固定10min。 2. 染色 通常采用瑞氏(Wright)染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞-姬混合染色法。有條件的實驗室,可使用美國CDC推薦的染色方法。 3. 染液配置方法 (1)瑞-姬染液:取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g,以甲醇研溶,加甲醇500ml保存,每天搖勻1次,1周后可使用。 (2)改良Mc Donald法瑞-姬染色劑:75 ml甘油(分析純)中加入磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g),以4 ml蒸餾水溶解,37 ℃水浴24 h溶解混勻,用濾紙過濾,保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞-姬染色劑50 ml,混勻后備用。4. 染色步驟 血推片或白細胞涂片分別以兩種染色劑染色2 min,再加蒸餾水作用5 min,用自來水沖洗。 5. 結(jié)果觀察 中性粒細胞中可見桑葚狀包涵體(見圖1),并注意保存相關(guān)標本,以便進行復(fù)核。 (二)血清學(xué)檢測。 常用血清學(xué)方法為間接免疫熒光(IFA)法。采集急性期(發(fā)熱初期,一般發(fā)病1周內(nèi))與恢復(fù)期(至少間隔2-3周)雙份血清。如恢復(fù)期血清抗體檢測陰性,應(yīng)建議醫(yī)生采集第3份血液樣本(間隔2-4周)。 1. 試劑 使用國際推薦的、經(jīng)過ISO質(zhì)量認證的產(chǎn)品。 2. 方法及操作按說明書進行。 3. 結(jié)果解釋 IFA檢測結(jié)果解釋按說明書進行。 如果同時檢測雙份血清,IgG抗體4倍升高,則結(jié)果強烈支持嗜吞噬細胞無形體感染。如果急性期抗體升高,而恢復(fù)期沒有升高或輕微升高,則應(yīng)采集第3份血液樣本(間隔2-4周)進行進一步檢測。 (三)嗜粒細胞無形體核酸PCR檢測。 目前,國際推薦使用16S rRNA基因檢測方法,有條件的實驗室,可進一步選用熱休克蛋白基因groEL擴增方法。 1. DNA提取 用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細胞及蜱研磨液提取DNA。最后,以AE緩沖液50μl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細胞層提取DNA,可明顯提高陽性檢出率。實驗時,應(yīng)采集當?shù)卣H搜和瑫r提取DNA,作為PCR的陰性對照。 2. PCR擴增 (1)16S rRNA基因檢測:16S rRNA 高度保守,是PCR檢測最常用的擴增靶基因,巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異度,采用屬特異及種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應(yīng)分區(qū)進行,避免污染。使用引物序列見表1。 表1 巢式PCR檢測無形體及埃立克體16S rRNA基因常用引物 引物名稱 序 列 片段長度(bp) Eh-out1(AF414399) 5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’ 653 Eh-out2(AF414399) 5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’ Eh-gs1(AF414399) 5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’ 282 Eh-gs2(AF414399) 5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’ HGA1 5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’ 389 HGA2 5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’ PCR反應(yīng)混合物的準備按常規(guī)進行。第一輪反應(yīng)采用外引物對Eh-out1和Eh-out2,DNA模板10μl(白細胞提取的DNA可適當減少)。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl或50μl(需要進行PCR測序或克隆時,應(yīng)適當擴大反應(yīng)體系),其它成分的濃度按常規(guī)進行。反應(yīng)程序如下: 94℃ 5min 40循環(huán):94℃ 45sec 55℃ 50sec 72℃ 1min 72℃ 總延伸 5min 第二輪反應(yīng)使用2對引物分別進行巢式PCR。2對引物分別是無形體屬及埃立克體屬通用內(nèi)引物(Eh-gs1、Eh-gs2);以及HGA種特異性引物(HGA1及HGA2)。檢測樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板,陽性對照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。 (2)熱休克蛋白基因groEL擴增 與groEL基因的應(yīng)用相比,16S rRNA基因的應(yīng)用更為廣泛,但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此,對于診斷及菌株的鑒定,groEL基因均具有重要意義。該基因擴增使用巢式PCR,引物序列見表2。 表2 groEL基因擴增常用引物 引物名稱 序 列 退火溫度 片段長度bp) HS1 5’-TGG GCT GGT A(A/C)TGA AAT 52℃ 1431 HS6 5’-CCI CCI GGI ACI A(C/T)ACC TTC HS43 5’-AT(A/T)GC(A/T) AA(G/A)GAA GCA TAG TC 55℃ HGA480 HS45 5’-ACT TCA CG(C/T)(C/T)TCA TAG AC HME528 DNA提取同上。PCR檢測時,反應(yīng)混合物的準備按常規(guī)進行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測。巢式PCR第一輪反應(yīng)采用外引物對HS1及HS6。 反應(yīng)程序如下: 3循環(huán):94℃ 1min 48℃ 2min 70℃ 90sec 37循環(huán):88℃ 1min 52℃ 2min 70℃ 90sec 68℃ 總延伸 5min 第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板,陽性對照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng),但退火溫度由52℃改為55℃。 3.測序及分析 對擴增產(chǎn)物進行測序并進行同源比較,分析當?shù)亓餍兄昱c其它地區(qū)的變異性。 (四)病原體分離培養(yǎng)。 多用HL-60進行嗜吞噬細胞無形體的分離培養(yǎng)。最常用的分離方法是將白細胞部分接種培養(yǎng)基,然后將100-500μl抗凝血接種到懸浮有2×105或1×106細胞內(nèi), 每2-3天染色檢查包涵體,一般5-10天可查見包涵體。由于分離可能受到紅細胞的影響,因此,建議使用以下方法: 1.白細胞分離:采用密度梯度離心方法(Ficoll-Paque)。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血,用2倍體積的無菌Hanks 平衡鹽溶液稀釋,最后采用Histopaque(Sigma,St . louis, Mo)密度梯度離心分離白細胞,可以獲得較高的白細胞,用以分離HGA。采用白細胞分離方法進行接種時,應(yīng)注意防止操作過程中的污染。 2. 紅細胞裂解后收集白細胞(NHCl4裂解法)。 3. 在使用含有紅細胞的標本培養(yǎng)后,另加入宿主未感染的細胞,建立混合培養(yǎng)。 血液白細胞懸浮于2ml體積、含有5-10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,且在25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)與培養(yǎng)細胞作用3小時。37℃、5% CO2 條件下振搖孵育,可增加病原體與細胞的作用。 病原體的鑒定:可通過種特異引物進行PCR鑒定。 五、生物安全 在標本采集、運輸及實驗室工作過程中,生物安全應(yīng)參照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》中的有關(guān)要求進行。 (一)實驗室生物安全。 標本滅活、病原DNA標本提取及病原體分離操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級實驗室進行。非感染性材料的檢測可在生物安全I級實驗室進行。 (二)血液標本采集安全注意事項。 采集病例的標本時,應(yīng)做好個人防護。采集者應(yīng)戴乳膠手套,盡量避免病例的血液外溢或直接接觸。如發(fā)生血液外溢污染環(huán)境時,應(yīng)及時采用75%酒精或常用消毒劑進行消毒處理。應(yīng)按照對傳染性樣本的要求,對采集標本的器具及病人止血棉球及時進行消毒處理。防止銳器扎傷皮膚,一旦發(fā)生,應(yīng)按臨床外科要求,及時進行傷口清創(chuàng)。如直接沾染了臨床診斷病例或確診病例的血液,除及時消毒皮膚外,應(yīng)口服強力霉素預(yù)防感染,服用劑量參照《人粒細胞無形體病診療方案(試行)》(附件1)。 (三)采集動物宿主與媒介蜱標本個人防護。 野外采集標本時,應(yīng)穿著顏色明亮的防護服,并將衣袖或褲管口扎緊以防蜱叮咬人體,且容易發(fā)現(xiàn)蜱的附著。一旦發(fā)現(xiàn)有蜱附著體表,應(yīng)用鑷子夾取,不要用手直接摘除。野外作業(yè)或活動的人員可使用驅(qū)避劑或防蚊油噴涂皮膚,也可用硫化鉀代替防蚊油。 (四)標本運輸安全注意事項。 應(yīng)參照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》中的有關(guān)要求(B類)進行。 (五)在診療及標本的采集、包裝和實驗室檢測等過程中所產(chǎn)生的醫(yī)療廢物,應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》等相關(guān)規(guī)定處理。 附件4 人粒細胞無形體病專題調(diào)查方案 (試行) 為指導(dǎo)發(fā)生疫情的地區(qū)開展人粒細胞無形體病的調(diào)查,增進對該病病原學(xué)、傳播機制、危險因素及臨床診斷等的認識,為制訂相應(yīng)的防控策略和措施提供科學(xué)依據(jù),特制訂本方案。 一、調(diào)查目的 (一)了解人粒細胞無形體病疫區(qū)人群感染狀況及抗體水平。 (二)了解人粒細胞無形體病主要的潛在傳播媒介的種類、分布及帶菌狀況。 (三)了解人粒細胞無形體病常見的動物宿主種類、分布及帶菌狀況。 二、調(diào)查內(nèi)容與方法 (一)血清流行病學(xué)調(diào)查。 1. 調(diào)查對象 (1)可能暴露者:與患者有類似暴露史的人員(暴露于有可疑野生動物或蜱的生境)。 (2)密切接觸者:與患者密切接觸者(參與救治的醫(yī)護人員、護理患者的家屬等)。 (3)一般人群:與患者無密切接觸,也無可疑生境暴露者。 2. 標本采集 對所有密切接觸者應(yīng)采集雙份血清,間隔3-4周,另應(yīng)采集可能暴露者及一般人群血清各30-50份。每次采集靜脈血5ml,分離血清送檢。血清標本的包裝、貯存及運送見《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》(附件3)。 3. 標本檢測 采集的標本應(yīng)及時送有條件的省級疾病預(yù)防控制中心進行抗體檢測。如當?shù)責o檢測條件,應(yīng)送中國疾病預(yù)防控制中心進行檢測。檢測方法及注意事項見《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》(附件3)。 (二)宿主動物調(diào)查。 根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查的線索,確定是否進行宿主動物的調(diào)查。 1. 調(diào)查地點和時間 在病例可能感染的地點,或根據(jù)當?shù)氐牡乩砭坝^,選擇宿主動物調(diào)查的地點。調(diào)查時間可選擇在疫情發(fā)生后或宿主動物活動高峰季節(jié)。 2. 捕獲方法 (1)居民區(qū)采用籠夜法。在鼠類經(jīng)常出沒的場所,于傍晚時在每15m2的房間放置鼠籠一個,并做好標記。誘餌用花生米或油條、油餅等(同一地區(qū)應(yīng)選用同一種誘餌)。次日清晨取回鼠籠,將捕獲鼠的鼠籠放入布鼠袋內(nèi),系緊袋口,做好記錄,并編號。 (2)野外采用夾(籠)夜法。在有鼠活動的場所,于傍晚時布放鼠夾(籠),夾(籠)的行距應(yīng)在30m以上,夾(籠)間距為5m,并做好標記。誘餌應(yīng)統(tǒng)一。次日清晨取回夾(籠),將捕獲鼠放入布鼠袋內(nèi),系緊袋口,做好標記,并編號。如捕白天活動的鼠,采用夾(籠)日法。 (3)鼠類以外的其它野生宿主動物(如野兔等)可通過有關(guān)渠道獲取。 3. 標本處理 (1)采集動物血標本待檢。 (2)解剖前,將所捕宿主動物(如鼠等)置于密閉容器內(nèi),用乙醚深度麻醉。將動物(鼠)置于白瓷盤中,先用鑷子夾取盤中和動物(鼠)體表的寄生物,如蜱、螨、蚤等,寄生物按鼠只分別置入盛有75%酒精的密閉容器中,并標記相應(yīng)鼠只的編號;然后,采用無菌方法解剖動物(鼠),取其脾、肝、腎標本,置入相應(yīng)編號的無菌凍存管內(nèi),于液氮罐內(nèi)保存。無液氮罐保存條件的,應(yīng)置-20℃環(huán)境保存。 上述標本送回實驗室后,應(yīng)盡快檢測。否則,應(yīng)置-80℃超低溫、或-20℃低溫冰箱內(nèi)保存。 4.動物的分類、鑒定 參考《醫(yī)學(xué)動物鑒定手冊》等相關(guān)專業(yè)資料,鑒定宿主動物的種類、學(xué)名等。 5. 核酸檢測及病原分離 (1)采用PCR擴增動物血液標本的DNA,并測定核苷酸序列。 (2)有條件的實驗室應(yīng)對陽性標本進行病原體分離。陽性病原分離物送中國疾病預(yù)防控制中心作進一步鑒定。 方法見附件3《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》。 6. 計算動物(鼠)種的構(gòu)成、密度及其帶菌率。 (三)蜱的調(diào)查。 1. 調(diào)查地點和時間 在病例可能感染的地點,或根據(jù)當?shù)氐牡乩砭坝^選擇媒介蜱的調(diào)查地點。調(diào)查時間可選擇在疫情發(fā)生后,或蜱活動高峰季節(jié)。 2. 捕獲方法 (1)布旗法。用約1平方米大小的白絨布旗,在調(diào)查地段內(nèi)定時進行拖蜱。拖蜱時,手持旗桿伸向一側(cè),使布旗平鋪于草叢上,以等速緩步向前行走,每步行2米觀察一次,將附著于旗上的蜱撿入玻管內(nèi)保存。每小時檢獲蜱數(shù)即為蜱密度,單位為只/布旗人工小時,每次捕蜱時間不少于1小時(如蜱密度單位采用只/布旗人工分鐘,每次捕蜱時間一般不少于30分鐘)。同時,檢查拖蜱者身體上是否附著有蜱,如有,將蜱撿入另一玻管內(nèi)保存,以區(qū)別于布旗法捕獲的蜱。凡拖過蜱的地方,短時間內(nèi)不應(yīng)在原地重復(fù)調(diào)查。 (2)帶蜱指數(shù)調(diào)查法。用鼠籠在有蜱活動的地方捕捉活鼠,鼠體上蜱的采集可參照宿主動物體外寄生物采集方法進行。平均每只鼠體上的蜱數(shù)即為帶蜱指數(shù),單位為只/鼠。家養(yǎng)動物或其它野生動物用適當方式制動固定后,可直接檢蜱,計算帶蜱指數(shù)。 3. 蜱的分類、鑒定 參考有關(guān)專業(yè)資料,對捕獲的蜱進行分類、鑒定、命名(學(xué)名)。若當?shù)責o法鑒定,可將采集到的雌、雄蜱各若干只置于75%乙醇溶液中保存,送中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所鑒定。 4. 核酸檢測及病原分離 (1)采用PCR擴增蜱標本的DNA,并測定核苷酸序列。 (2)有條件的實驗室應(yīng)對陽性蜱標本進行病原分離。陽性病原分離物送中國疾病預(yù)防控制中心作進一步鑒定。 方法見附件3《人粒細胞無形體病實驗室檢測方案(試行)》。 5. 計算蜱種的構(gòu)成、總帶菌率及各種蜱的帶菌率。 三、資料的收集、管理和利用 (一)一般背景資料的收集。 收集當?shù)氐囊话惚尘百Y料,如調(diào)查時當?shù)氐臍庀筚Y料(氣溫、降雨量、濕度、風力、風向等)、地理狀況(地理位置、地形、地貌、湖泊、河流、流域等)、人口統(tǒng)計學(xué)資料、生產(chǎn)及生活方式(農(nóng)、牧業(yè)、狩獵等活動)、生活及衛(wèi)生習慣、特殊風俗、社會經(jīng)濟狀況以及其他相關(guān)資料等。 (二)專題調(diào)查相關(guān)資料的收集。 收集專題調(diào)查的相關(guān)資料,包括各種采樣(人體血清、宿主動物標本、媒介蜱)登記表、檢測登記表、檢測報告,以及各類專題調(diào)查(血清采集、宿主動物調(diào)查、媒介蜱調(diào)查)統(tǒng)計表等(見附表1-8)。 (三)資料的管理和利用。 現(xiàn)場調(diào)查結(jié)束后,應(yīng)及時撰寫專題調(diào)查報告,上報上級疾控機構(gòu)及同級衛(wèi)生行政部門,并將專題調(diào)查的原始記錄、匯總整理資料、分析數(shù)據(jù)及調(diào)查報告等及時整理、歸檔。實驗室檢測工作結(jié)束后,應(yīng)及時將檢測結(jié)果反饋給當?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu),由當?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)告知相關(guān)單位及被調(diào)查者。 附表1 血清標本采集登記表 采血時間: 地點: 編號 姓名 性別 年齡 職業(yè) 住址 蜱叮咬史 發(fā)病日期 發(fā)熱史 臨床診斷 采血日期 采集量 備注 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表2 血清標本嗜吞噬細胞無形體抗體檢測登記表 編號 姓名 采集時間 檢測時間 檢測方法 檢測項目及結(jié)果 備 注 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表3 嗜吞噬細胞無形體宿主動物標本采集登記表 編號 地點 鼠種 雌/雄 體外寄生蟲 標本種類 備 注 蜱 蚤 螨 捕鼠日期: 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表4 嗜吞噬細胞無形體宿主動物標本檢測登記表 編號 動物/臟器種類 檢測時間 檢驗項目及結(jié)果 備 注 16S rRNA groEL IgG抗體 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表5 嗜吞噬細胞無形體媒介蜱采集登記表(布旗法) 編號 捕獲日期 捕獲地點 來源 蜱種 備注 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表6 媒介蜱嗜吞噬細胞無形體檢測登記表 編號 捕獲日期 捕獲數(shù)量 捕獲地點 檢驗項目及結(jié)果 備 注 16S rRNA groEL 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表7 嗜吞噬細胞無形體宿主動物調(diào)查統(tǒng)計報表 時間: 地區(qū): 調(diào)查時間 調(diào)查地點 感染率 總鼠密度 鼠種1 鼠種2 鼠種3 鼠種4 合計(總感染率) 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 附表8 媒介蜱帶菌調(diào)查統(tǒng)計報表 時間: 地區(qū): 調(diào)查時間 調(diào)查地點 帶菌率 蜱種1 蜱種2 蜱種3 蜱種4 合計(總帶菌率) 送檢單位: 送檢人: 送檢日期: 衛(wèi)生部辦公廳 2008年2月20日印發(fā) 校對:徐 敏

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